Родиной святителя Серапиона было село Пехорка в 20-ти поприщах от Москвы; о родителях же его известно только, что они были поселяне, люди верующие и благочестивые. На седьмом году от рождения Серапион начал обучаться грамоте, а затем в раннем сравнительно возрасте хотел удалиться от мира, но родители не позволили сделать этого. Уступая их желанию, он вступает в брак и принимает сан священства; через год умерла его жена, Серапион постригается в монашество, но для покоя родителей и после пострижения остается для служения при той же Покровской церкви.
Когда же скончались его родители, Серапион отпустил на волю рабов отца своего, имущество раздал бедным и поступил в Дубенский Успенский монастырь, что на острове; вскоре он сделан был строителем этой обители, много потрудился для монастыря и так прославился своими иноческими подвигами, что самая обитель стала называться пустынью Серапиона.
Желая предаться богомыслию и строгим подвигам, Серапион сложил с себя обязанности строителя обители и перешел в Троице-Сергиеву Лавру при игумене Симоне. Этот Симон был поставлен митрополитом Московским в 1495 году, а святой Серапион волею митрополита и великого князя тогда же сделан был игуменом Лавры.
Святой Серапион пользовался большим уважением великого князя Иоанна Васильевича, и был случай, когда по ходатайству святого Серапиона он помиловал осужденных на казнь. Недобрые люди оклеветали перед великим князем трех боярынь, обвинив их в волшебстве. Иоанн Васильевич страшно опалился на них и присудил к смерти через сожжение. За невинно осужденных печалуется митрополит Симон соборно с духовенством своим, просят бояре, но без всякого успеха. Тогда святой Серапион, помолясь Живоначальной Троице, Пречистой Богородице и преподобному Сергию, отправился к великому князю и наедине со слезами начал печаловаться за несчастных боярынь, прося освободить их от смертной казни. Великий князь умилился просьбой Троицкого игумена, перестал гневаться, умилостивился до того, что без всякого наказания освободил боярынь.
Выделился своим благоразумием святой Серапион и на Соборе 1504 года, когда горячо отстаивал церковные и монастырские имения как средство благотворительности. Святой Серапион очень заботился о вверенной ему обители преподобного Сергия, был рачительным хозяином, берег ее вотчины и монастырские запасы, собранные в многочисленных селах и деревнях.
Великий князь Иоанн Васильевич при передаче царства своему сыну Василию указал на святого Серапиона как на одного из достойнейших к занятию архиерейской кафедры. Великий Новгород в то время более двух лет не имел своего святителя. Избрание пало на святого Серапиона, и 15 января 1506 года собором архипастырей он был хиротонисан в архиепископа Новгородского.
Попущением Божиим наступили тогда для Новгорода тяжелые времена. Третий уже год Новгород страдал от смертоносной язвы; в 1508 году мор был особенно силен: в одну осень умерло 15396 человек. В том же году страшный пожар опустошил торговую сторону Новгорода: при страшной буре огонь действовал с такою силою, что люди не успевали спасаться.
Немалые скорби пришлось понести святителю Серапиону среди этих бедствий. Непрестанно молясь о прекращении страшной болезни, святитель Серапион с иконами и крестами ходил около города, велел в один день срубить и поставить церковь во имя Похвалы Богородицы на Детинце и в тот же день (15 октября) освятил ее. В то время молитвами святого архиепископа Серапиона исцелил Господь Бог трех человек: слепого, расслабленного и бесноватого. После этого чуда смертоносная язва немедленно прекратилась.
Во время пожара архиепископ с иконами и крестами вышел на Волховский мост к Чудному кресту, но не мог выговорить слова на молебне, сильно рыдал, источая слезы из очей своих, как струи, непрестанно, и молился в тайне сердца своего, пока прекратился гнев Божий.
В то же время случилась великая распря святителя Серапиона с игуменом Волоколамского монастыря преподобным Иосифом. Волоколамская обитель находилась тогда в ведении Новгородского владыки. Великий князь принял обитель под свое покровительство, а когда узнал владыка Серапион о переходе Волоколамской обители к великому князю, то очень огорчился и без сношения с великим князем и митрополитом запретил игумена Иосифа в священнослужении и отлучил от Церкви.
Великий князь тогда же лишил архиепископа престола, вытребовал в Москву и заточил в Андрониевском монастыре. В 1509 году на соборе архипастырей собор простил и благословил игумена Иосифа, владыке же Серапиону определил пребывать в монастыре.
Митрополит перед своею смертью примирился с святым Серапионом в 1511 году, пригласил его в Москву к себе, благословил и сам принял от него прощение. Тогда же последовало примирение с владыкою Серапионом и преподобного Иосифа. Сам великий князь Василий Иоаннович смиловался и позволил владыке Серапиону переселиться в Троице-Сергиев монастырь, где он много подвизался в посте, молитве, глубоком смирении и терпении.
Перед кончиною своею святой Серапион принял схиму; простившись с братией обители Преподобного Сергия и причастившись Святых Тайн, он скончался 16 марта 1516 года со словами на устах: «Господи, в руце Твои предаю дух мой». Необыкновенною радостью осветилось лицо почившего святителя; со слезами и скорбью погребли иноки владыку Серапиона близ церкви Живоначальной Троицы.
Святые мощи его обретены нетленными в следующем 1517 году, 7 апреля, и почивают под спудом в Троице-Сергиевой Лавре, на южной стороне Троицкого собора, где прежде была келлия преподобного Сергия.
Бог прославил Своего угодника особым даром чудотворений и прозорливости как при жизни, так и после блаженной его кончины. Однажды святитель Серапион в праздник Успения Пресвятой Богородицы пригласил к себе на пир старейшин града и множество народа; среди пришедших был один хромой, который ползал много лет на ногах и руках, опираясь на деревяшки. Святой Серапион со слезами помолился Господу об исцелении больного и сказал хромому: «Во имя Господа Бога и Спаса нашего Иисуса Христа востани на ноги твои». Хромой поднялся на ноги, подошел к архиепископу и принял от него благословение.
Провидел святитель Серапион будущую судьбу своего любимого ученика архидиакона Иакова и еще в юношеском возрасте его поклонился ему как будущему игумену Троице-Сергиева монастыря, что и исполнилось: Иаков игуменствовал в Троицкой Лавре с 1515 по 1520 гг.
В 1608 году, в тяжелую годину Троице-Сергиевой Лавры, на призыв святого Сергия вошел в храм святой Серапион в святительском облачении и с поднятыми к небу руками молился в алтаре перед иконою Пресвятой Богородицы.